过表达稳转细胞系构建

基因过表达细胞株构建服务包括目的基因过表达慢病毒载体构建、病毒包装、细胞转染和筛选。您只需提供目的基因的cDNA质粒或目的序列信息和需要构建的细胞系，我们将按照您的要求完成目的基因过表达细胞株的构建和检测，提供给您高质量的基因过表达稳定细胞株。

服务特点

1、多种不同启动子和标签的慢病毒表达载体可供选择。

2、采用慢病毒系统构建，基因整合稳定。

3、根据您的需要可以提供经济实惠的多克隆细胞系或者高品质的单克隆细胞系。

您需提供的资料

1.客户提供目的基因的序列，如果提供模板，请告知载体、酶切稳点等信息；

2.若实验材料为原代细胞或者特殊培养的细胞，请先咨询；

3.公司默认提供病毒滴度为1x107-1x108TU/ml,规格1ml；

4.目的蛋白的功能验证另外收费。

我们提交的内容

1、实验报告内容：

A 慢病毒载体构建报告及测序结果。

B 细胞筛选实验报告。

C 目的基因表达检测结果。

2、产品内容：

A 已构建慢病毒载体；

B 多克隆细胞系构建服务提供目的基因过表达细胞株及EGFP表达对照细胞株各一株，单克隆细胞株构建服务提供目的基因过表达单克隆细胞株2-3株及EGFP过表达对照细胞株一株。

原代细胞培养

将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，麟美生物提原代培养服务供给您高质量的原代细胞株。

服务特点

1、原代细胞分离培养与鉴定(鉴定可提供流式细胞仪检测、免疫细胞化学、RT-PCR 、蛋白免疫印迹等多种方法检测)。

2、细胞传代代数低(一般4代)，细胞状态好，无污染。

3、根据您的需要可以提供多种原代培养的细胞。

您需提供的资料

1、详细说明进行原代细胞培养的组织，并确定组织是由客户提供还是本公司提供。

2、尽可能提供该原代细胞的培养条件，或者由本公司摸索培养条件。

3、对于一些常见的原代培养组织，因为保存运输的不便可能会降低原代培养的成功率，建议客户选择由本公司提供相应的组织。

我们提交的内容

提供冻存或处于对数生长期的细胞株一瓶(细胞培养条件，图片)。

干细胞培养服务

提供广泛的干细胞产品，覆盖胚胎和诱导多能干细胞，神经干细胞，间充质干细胞（MSC），造血干细胞和癌症干细胞等干细胞培养服务。

服务特点

1、干细胞分离培养与鉴定(鉴定可提供流式细胞仪检测、免疫细胞化学、RT-PCR 、蛋白免疫印迹等多种方法检测)。

2、细胞传代代数低(一般4代)，细胞状态好，无污染。

3、根据您的需要可以提供多种原代培养的细胞。

细胞增殖

一、流式荧光染色法

原理：

荧光染料CFSE， 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到**代细胞中，这样与**代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比**代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。

实验步骤，以小鼠脾细胞为例：

1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；

2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；

3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；

4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；

5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；

6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；

7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；

8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；

9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，*后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；

10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。

结果分析：用FlowJo分析细胞增殖

在FSC/SSC 上圈出目标细胞，使用 FSC-W/FSC-A 排除黏连体，使用 CFSE 单参看目标细胞的增殖情况。以下图片来源于网络：细胞摄取染料后，信号强，在右边（不分裂的话，就是那个桃红色的峰），随着细胞的每一次分裂，细胞内染料的浓度被稀释一倍，信号也减弱一半，以此类推，由于细胞的分裂不同步，所以*后的结果是红色的那些齿状的峰。

实验要点：

CFSE的浓度国外报道从0.5uM-20uM都有，建议终浓度为2.5-5uM。浓度太低，细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时要经常摇匀。

二、CCK-8法

实验原理：

CellCounting Kit-8（简称CCK-8）中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye），生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

细胞周期

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等。

一、BrdU法

1、原理

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

细胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小时）

2、仪器、用品与试剂

2.1、仪器、用品：同常规细胞培养

2.2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

3、操作步骤

3.1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使*终浓度为10μg/ml。

3.2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3.3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

3.4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。

3.5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

3.6、弃去2×SSC液，流水冲洗。

3.7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

3.8、镜检100个分裂相，计**、二、三、四细胞期分裂指数。

3.9、计算：

（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠·2H2 O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

附： （1）BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

二、PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等*后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。

3、细胞染色

离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响） 。

4、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在*前面还有细胞碎片峰。

结果解读

G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76

G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43

S期占25.73

G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）

峰的变异系数为4.54%（好）

细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。

总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，

在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。

细胞凋亡

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

一、实验步骤：

1.  凋亡细胞的制备

小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg体重，10 h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2×106 /ml，备用。

2.  200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm 4 ℃离心10 分钟，弃上清。

3.  重复步骤2两次。

4.  将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。

5.  加入10 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 分钟或4 ℃反应30 分钟。

6.  加入300 μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。

二、注意事项：

1.  整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。

2.  反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。

3.  Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

三、实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

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