荧光标记的siRNA

荧光标记的siRNA  Fluorescent dye labeled siRNA

荧光标记的siRNA

我们可对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到，确定转染效率，优化转染条件;标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

我们可对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到，确定转染效率，优化转染条件;标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。反义链5'端标记会影响其基因沉默活性，所以不推荐在这一位点进行标记。在其他三个末端修饰对沉默活性几乎没有影响。我们推荐在正义链的5'端修饰，目前公认这是*佳的化学标记位点。

本公司提供的siRNA相关产品直接作用于靶基因mRNA，因此我们建议您在收到我们的相关产品后先进行实时定量PCR检测，以确定靶基因mRNA表达水平的变化，进而直接确认我们合成或构建的siRNA产品是否有效。

使用方法

一、荧光标记的siRNA

转染效率的高低可以通过荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）实现。

FAM-siRNA 转染细胞后，可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测，确定是否有效转染和优化转染条件。FAM-siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

二、使用荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）检测转染效率

1 FAM-siRNA的溶解及保存

1.1 由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开离心管前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时加适量DEPC水后盖上管盖，振荡溶解。

1.2 需要浓度20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？你购买了1OD的siRNA，想溶解为20uM 的样品，应该使用150ul附送的DEPC水去重悬1OD的siRNA,溶解后为20uM的样品。

1.3 贮存和稳定性：-20℃，避光保存，冻干粉或液体。液体（贮存浓度为20μM）避免反复冻融，**********保证在上述条件下siRNA oligo的稳定性可达到6个月。

2 转染

2.1 使用lipofectamin2000 转染的步骤（以贴壁细胞为例，仅供参考）

(1)以24孔培养板操作为例（其他孔板各种的试剂用量，请参照“Lipofectamine2000 manual”），转染前**，将0.5~2X105个细胞接种于培养板中，每孔中加入约500ul无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30～50％；

(2) 取1μl/孔 Lipofectamine2000（使用前轻轻摇匀），用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min；

(3) 取2ul FAM-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释，轻轻混和均匀;

(4) 稀释的Lipofectamine2000（2）经过5min 的孵育后，与稀释FAM-siRNA（3）轻轻混和，室温静置20min，以形成FAM-siRNA-转染试剂混和物，如果溶液出现浑浊，属于正常现象，不会影响转染效果。

注意：稀释的Lipofectamine2000（2）尽量在25min 之内，和稀释的FAM-siRNA 混和，如果放置时间过长，可能导致转染试剂活性的降低;

(5) 将FAM-siRNA-转染试剂混和液（4）加入含有细胞及培养液（约含400ul）的孔中，轻轻摇晃孔板，使混和；

(6) 在37 ℃的CO2 培养箱中培养，4-6 小时后可将培养基换为含血清的完全培养基(该步骤可以省略);

(7)转染6小时后即可检测转染效率：流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等（见后面）。

2.2 转染操作注意事项：

（1）FAM-siRNA 的转染过程和普通siRNA 是一样的，注意整个实验过程要尽量避光，建议转染时室内和超净台内不要开灯；

（2）保持FAM-siRNA 管外有锡纸包裹，在静置lipo-siRNA 过程中尽量避光，

（3）转染操作尽量快，操作时间尽量短，操作完毕请尽快将培养板放到培养箱。

（4）一般来说，使用Lipofectamine 2000 作为转染试剂，4～6 小时就可以保证siRNA 转染进入细胞。因此转染效率的检测可以在转染后6小时（转染过程完成）进行。

3、观察与检测

3.1 检测方法：荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪

3.2 荧光显微镜观察注意事项（流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测请参照仪器说明书）：

（1）FAM 是一种绿色荧光基团，由蓝光激发，激发波长480nm，发射波长520nm。

（2）使用Lipofectamine 2000 转染后6 小时就可以检测，检测前细胞处理等操作都必须避光！对于检测的时间要求相对不是特别严格，成功转染的细胞如果没有受到强光刺激的话，荧光一般不会消失，我们建议尽量在转染后24 小时内完成检测。

（3）确保熟悉荧光显微镜操作。建议检测时，可以先使光路先对准没有转染FAM -siRNA的孔，调好焦距打开激发光，一切准备就绪后再进行观察（一般情况下可以马上看到荧光）。

（4）观察时间不宜过长，尽量避免荧光被猝灭，光路对准转染孔，马上观察和拍照。拍完荧光照片后，*好在同一视野中拍下明场的细胞照片。

（5）只有成功转染的细胞才能看到FAM 绿色荧光，与绿色荧光蛋白GFP 的荧光不太一样，FAM 的荧光比较弱，散在分布在细胞质中。

（6）由于荧光容易猝灭，应用计数的方法计算转染效率效果不好，*好用流式细胞仪检测。

（7）如果您对我们FAM-siRNA 质量有任何质疑的话，您可以从中吸取少量（2～5μl）FAM-siRNA，加在载玻片上，盖上盖玻片，直接于荧光显微镜下观察。注意保证FAM-siRNA 的保存和使用方法无误，另外，所有操作都必须在避光条件下进行。

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